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丙酮酸（pyruvic acid PA）含量测定试剂盒说明书

                                          微量法100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸叁大代谢，起着重要的枢纽作用。

测定原理：

丙酮酸与2,4-er硝箩颈苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙，在碱性溶液中呈显色。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100尘尝×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体2.5尘尝×1瓶， 4℃保存；

试剂二：液体12.5尘尝×1瓶， 4℃保存。

丙酮酸提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，25℃离心10min，取上清待测。

3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μ尝样本和25μ尝试剂一，混匀，静置2min，加入125μ尝试剂二，混匀，于520nm波长处测定管吸光值A。

丙酮酸含量计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0466x + 0.0675； x为丙酮酸含量（µg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（μ驳/尘尝）= 摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷（痴3×痴1÷痴2）=214.6×(础-0.0675)

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷(痴1×颁辫谤)=21.46×(础-0.0675) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量（µg/g鲜重）= 摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷(W ×痴1÷痴2）=21.46×(础-0.0675) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量（μ驳/10⁴ cell）＝摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷（500×痴1÷痴2）=0.043×(础-0.0675)

V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0233x + 0.0675； x为丙酮酸含量（µg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（μ驳/尘尝）= 摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷（痴3×痴1÷痴2）=429.2×(础-0.0675)

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷(痴1×颁辫谤)=42.92×(础-0.0675) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量（µg/g鲜重）= 摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷(W ×痴1÷痴2）=42.92×(础-0.0675) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量（μ驳/10⁴ cell）＝摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷（500×痴1÷痴2）=0.086×(础-0.0675)

V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意：窜低检测限为1μ驳/尘尝或1μ驳/驳鲜重或10ng/mg prot