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丙酮酸含量测定试剂盒说明书

发布时间:2023/10/25点击次数:491

丙酮酸(pyruvic acid PA含量测定试剂盒说明书

                                          微量法100/96

 

    意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸叁大代谢,起着重要的枢纽作用。

 

测定原理:

丙酮酸与2,4-er硝箩颈苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙,在碱性溶液中呈显色。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

提取液:液体100尘尝×1瓶,4保存;

试剂一:液体2.5尘尝×1瓶, 4保存;

试剂二:液体12.5尘尝×1瓶, 4保存。

 

丙酮酸提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),静置30min 8000g25℃离心10min,取上清待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,静置30min8000g25℃离心10min,取上清待测。

3、血清(浆)样品按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)15~10的比例(建议0.1mL血清(浆)加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,静置30min 8000g25℃离心10min,取上清待测。

测定步骤:

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm,蒸馏水调零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μ尝样本25μ尝试剂一,混匀,静置2min,加入125μ尝试剂二,混匀,于520nm波长处测定管吸光值A

 

丙酮酸含量计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0466x + 0.0675 x为丙酮酸含量(µg/mL),y为吸光值。

2、按照血清(浆)体积计算

丙酮酸含量(μ驳/尘尝= 摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷痴3×痴1÷痴2=214.6×(础-0.0675)

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量(μg/mg prot=摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷(痴1×颁辫谤)=21.46×(础-0.0675) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量(µg/g鲜重)= 摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷(W ×痴1÷痴2=21.46×(础-0.0675) ÷W

 

3、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量(μ驳/104 cell)=摆(础-0.0675)÷0.0466×痴1闭÷500×痴1÷痴2=0.043×(础-0.0675)

V1:加入反应体系中样本体积,0.075mLV2:加入提取液体积,1 mLV3:加入血清(浆)体积,0.1 mL Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

b. 96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0233x + 0.0675 x为丙酮酸含量(µg/mL),y为吸光值。

2、按照血清(浆)体积计算

丙酮酸含量(μ驳/尘尝= 摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷痴3×痴1÷痴2=429.2×(础-0.0675)

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量(μg/mg prot=摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷(痴1×颁辫谤)=42.92×(础-0.0675) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量(µg/g鲜重)= 摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷(W ×痴1÷痴2=42.92×(础-0.0675) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量(μ驳/104 cell)=摆(础-0.0675)÷0.0233×痴1闭÷500×痴1÷痴2=0.086×(础-0.0675)

V1:加入反应体系中样本体积,0.075mLV2:加入提取液体积,1 mLV3:加入血清(浆)体积,0.1 mL Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

注意:窜低检测限为1μ驳/尘尝1μ驳/驳鲜重或10ng/mg prot

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