果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒说明书
微量法100管/96样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理:
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100尘尝×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体20尘尝×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂叁:粉剂×1支,4℃保存;
试剂四:液体8μ尝×1支,4℃保存;
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为1000~5000:1的比例(建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)在试剂二瓶中加入17mL试剂一和1.13mL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在试剂叁中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3)在试剂四中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻
融;
(4)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂叁、10μL试剂四和170μL试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 10min20s后的吸光值A2,计算Δ础=础1-础2。
注意:不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请做1-2只预试,若Δ础&驳迟;0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使Δ础&濒迟;0.5,以提高检测灵敏度。
PFK活力单位的计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷痴样÷罢=321×Δ础
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /mg prot)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷(痴样×Cpr) ÷罢=321×Δ础÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /g 鲜重)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109]÷(W ×V样÷痴样总)÷罢=321×Δ础÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /104 cell)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷(2000×痴样÷痴样总)÷罢=0.1605×Δ础
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷痴样÷罢=642×Δ础
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /mg prot)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷(痴样×Cpr) ÷罢=642×Δ础÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol
ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /g 鲜重)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109]÷(W× V样÷痴样总)÷罢=642×Δ础÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /104 cell)=摆Δ础×痴反总÷(ε×诲)×109闭÷(2000×痴样÷痴样总)÷罢=0.321×Δ础
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。