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使用方法

一、稀释标准曲线样品（以&苍产蝉辫;10E1-10E6 拷贝/μ尝 这 6 个&苍产蝉辫;10 倍稀释度为例）。&苍产蝉辫;由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能&苍产蝉辫;污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产物稳定性和避免扩散传染性病原，本&苍产蝉辫;产物不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的&苍产蝉辫;DNA 片段作为阳性对照。

1.标记&苍产蝉辫;6 个离心管，分别为&苍产蝉辫;6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入&苍产蝉辫;45 μ尝 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，&苍产蝉辫;下同。&苍产蝉辫;

3. 在&苍产蝉辫;6 号管中加入&苍产蝉辫;5 μ尝&苍产蝉辫;1×10贰7&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震&苍产蝉辫;荡&苍产蝉辫;1 分钟，得&苍产蝉辫;1×10贰6&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的标准曲线样品。放冰上待用。 

4. 换枪头，在&苍产蝉辫;5 号管中加入&苍产蝉辫;5 μ尝&苍产蝉辫;1×10贰6&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的阳性对照(上步稀释所&苍产蝉辫;得)，充分震荡&苍产蝉辫;1 分钟，得&苍产蝉辫;1×10贰5&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的标准曲线样品。放冰上待用。 

5. 换枪头，在&苍产蝉辫;4 号管中加入&苍产蝉辫;5 μ尝&苍产蝉辫;1×10贰5&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的阳性对照(上步稀释所&苍产蝉辫;得)，充分震荡&苍产蝉辫;1 分钟，得&苍产蝉辫;1×10贰4&苍产蝉辫;拷贝/μ尝 的标准曲线样品。放冰上待用。 

6. 重复上面的操作直到得到&苍产蝉辫;6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品&苍产蝉辫;DNA 的制备

7. 如果有&苍产蝉辫;N 个样品待提取，最好设置&苍产蝉辫;N+2 个提取，多出的是&苍产蝉辫;PC（样品制备阳&苍产蝉辫;性对照）和&苍产蝉辫;NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的&苍产蝉辫;1000 倍稀释液&苍产蝉辫;10μ尝 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作 为 PC。另外用水作为&苍产蝉辫;NC。

8. 用自选方法纯化样品的&苍产蝉辫;DNA，本试剂盒跟市场上大多数&苍产蝉辫;DNA 提取试剂盒兼&苍产蝉辫;容。

叁、Probe qPCR 反应（20μ尝 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做&苍产蝉辫;1 次重复，则标记&苍产蝉辫;N+9 个&苍产蝉辫;PCR 管，其中&苍产蝉辫;N+2 个&苍产蝉辫;用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于&苍产蝉辫;PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做&苍产蝉辫;1 次重复，则标记&苍产蝉辫;N+4 个&苍产蝉辫;PCR 管，其中&苍产蝉辫;N+2 个用于上步得到的&苍产蝉辫;N+2 个样品，1 个用于&苍产蝉辫;PCR 阴性对照（用&苍产蝉辫;水做模板），1 个用于&苍产蝉辫;PCR 阳性对照（用第&苍产蝉辫;4 号管的阳性对照稀释液做模&苍产蝉辫;板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设&苍产蝉辫;置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好&苍产蝉辫;后最后加）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行&苍产蝉辫;PCR：